登革熱?IgM 捕捉ELISA 法（MacELISA）實(shí)驗(yàn)
發(fā)布時(shí)間：2014-3-8 9:20:13??????瀏覽次數(shù)：
登革熱IgM 捕捉ELISA 法（MacELISA）實(shí)驗(yàn)
陽性抗原：采用C6/36 細(xì)胞感染登革病毒培養(yǎng)物為陽性抗原。
陰性抗原：未接種病毒的正常C6/36 細(xì)胞為陰性抗原對照。
（2）抗人IgM（μ 鏈）單克隆抗體或多克隆抗體；
（3）登革病毒IgM 陽性、陰性對照血清；
（4）辣根過氧化物酶標(biāo)記登革病毒單克隆抗體；
（5）緩沖液：
洗滌液：pH7.4 PBS－T（0.05％吐溫－20）；
稀釋液：pH7.4 PBS（5％牛血清）；
封閉液：pH9.6 碳酸緩沖液（1％牛血清白蛋白）；
（6）顯色液：A/B 液
（7）終止液：4N H2SO4
（8）酶標(biāo)板、酶標(biāo)儀。
檢測步驟：
（1）用稀釋液按效價(jià)稀釋抗人μ 鏈單克隆抗體，100μl/孔，加蓋，4℃過
夜；
（2）棄去抗人μ 鏈，用洗滌液重復(fù)洗3 次，甩干，加封閉液，100μl/孔，
置37℃水浴孵育2 小時(shí)；
（3）棄封閉液，用洗滌液重復(fù)洗3 次，甩干。
（4）將待檢血清用稀釋液從1：10 開始作2 或4 倍連續(xù)稀釋，加入酶標(biāo)板
試驗(yàn)材料：
（1）抗原：陽性抗原：采用C6/36 細(xì)胞感染登革病毒培養(yǎng)物為陽性抗原。
陰性抗原：未接種病毒的正常C6/36 細(xì)胞為陰性抗原對照。
（2）抗人IgM（μ 鏈）單克隆抗體或多克隆抗體；
（3）登革病毒IgM 陽性、陰性對照血清；
（4）辣根過氧化物酶標(biāo)記登革病毒單克隆抗體；
（5）緩沖液：
洗滌液：pH7.4 PBS－T（0.05％吐溫－20）；
稀釋液：pH7.4 PBS（5％牛血清）；
封閉液：pH9.6 碳酸緩沖液（1％牛血清白蛋白）；
（6）顯色液：A/B 液
（7）終止液：4N H2SO4
（8）酶標(biāo)板、酶標(biāo)儀。
檢測步驟：
（1）用稀釋液按效價(jià)稀釋抗人μ 鏈單克隆抗體，100μl/孔，加蓋，4℃過
夜；
（2）棄去抗人μ 鏈，用洗滌液重復(fù)洗3 次，甩干，加封閉液，100μl/孔，
置37℃水浴孵育2 小時(shí)；
（3）棄封閉液，用洗滌液重復(fù)洗3 次，甩干。
（4）將待檢血清用稀釋液從1：10 開始作2 或4 倍連續(xù)稀釋，加入酶標(biāo)板
孔中，100μl/孔，同時(shí)加入已1：10 稀釋的陽性血清、陰性血清對照各4 孔,
100μl/孔，置37℃水浴孵育2 小時(shí)；
（5）棄去血清，用洗滌液重復(fù)洗3 次，甩干，分別加4 個(gè)型DV 抗原及陰性
抗原對照，100μl/孔，4℃過夜；
（6）棄抗原，用洗滌液重復(fù)洗3 次，甩干，加用稀釋液稀釋至工作濃度的
相應(yīng)的登革熱酶標(biāo)單克隆抗體，正?？乖? 個(gè)型混合的酶標(biāo)單克隆抗體，
100μl/孔，37℃水浴2 小時(shí)；
（7）棄去標(biāo)記物，用洗滌液重復(fù)洗3 次，甩干，于各反應(yīng)孔內(nèi)加A/B 液各一滴，37℃，避光3～5 分鐘；
（8）加終止液于每反應(yīng)孔，一滴/孔。
結(jié)果判斷：
（1）目測方法：
陽性對照孔呈明顯藍(lán)色，陰性對照孔呈無色，對照成立；若待檢血清孔呈明
顯淡藍(lán)色或深藍(lán)色（TMB），則標(biāo)本為登革熱IgM 抗體陽性，反之陰性。
（2）酶聯(lián)免疫檢測儀檢測：
于450nm（TMB）陽性對照孔OD 值/陰性對照孔OD 值，即P/N≥2.1，對照成
立；若待檢血清孔OD 值與陰性對照孔OD 比值≥2.1，則標(biāo)本為登革熱IgM 抗體
陽性，反之陰性。（陰性對照孔OD 值小于0.05 按0.05 記，若大于0.05 按實(shí)際
數(shù)值計(jì)算）
意義：
陽性結(jié)果，表明患者新近DV 感染，用于登革熱早期診斷。
- 上一篇：出國人員防瘧疾教材 2014/3/8
- 下一篇：登革熱IgG酶聯(lián)（ELISA）免疫吸附試驗(yàn) 2014/3/8
