原理

要進(jìn)行重組DNA 實(shí)驗(yàn)，就離不開外源基因的純化，而外源基因主要來源之一就要直接從生物的染色體DNA上制備，所以制備高質(zhì)量的染色體DNA樣品經(jīng)常為基因工程實(shí)驗(yàn)所需要(意義)。

【大家都知道，作為基因工程的載體必須滿足下面四個條件：1.是一個復(fù)制子，有復(fù)制點(diǎn)才能使與它結(jié)合的外源基因復(fù)制繁殖；2.他必須要有很高的復(fù)制率，這樣才能使外源基因在受體細(xì)胞中大量擴(kuò)增；3.有限制性內(nèi)切酶的識別位點(diǎn)，便于外源基因的插入；4.載體具有選擇的遺傳標(biāo)識，以此判斷載體是否進(jìn)入受體細(xì)胞，并將其分離出來。因此——】

基因工程實(shí)驗(yàn)所需要的基因組DNA 通常要求分子量盡可能大，以此增加外源基因獲得率，但要獲得大片段的DNA 非易事。對于細(xì)菌來說，細(xì)菌細(xì)胞具有堅(jiān)硬的細(xì)胞壁。提取難度將大于真核細(xì)胞。

細(xì)菌基因組DNA在抽提過程中，不可避免的機(jī)械剪切力必將切斷DNA，如果要抽提到大的DNA 分子，就要盡可能地溫和操作，減少剪切力，減少切斷DNA 分子的可能性；分子熱運(yùn)動也會減少所抽提到的DNA分子量，所以提取過程也要盡可能在低溫下進(jìn)行。另外細(xì)胞內(nèi)及抽提器皿中污染的核酸酶也會降解制備過程中的DNA，所以制備過程要抑制其核酸酶的活性。（溫和操作）。

另外制備的DNA 必須是高純度的，以滿足基因工程中各種酶反應(yīng)的需要，制備的樣品必須沒有蛋白污染，沒有RNA，各種離子濃度應(yīng)符合要求，這些在染色體制備時都應(yīng)考慮到。DNA不溶于95%的酒精溶液，但是細(xì)胞中的某些物質(zhì)則可以溶于酒精溶液。利用這一原理，可以進(jìn)一步提取出含雜質(zhì)較少的DNA。 并且用酒精可以洗脫在前幾步實(shí)驗(yàn)中使DNA攜帶的鹽離子（如何保證高純度）。

對于細(xì)菌而言，有染色體DNA和質(zhì)粒DNA，因此要將其分離開。處理過程中，細(xì)菌染色體DNA纏繞在細(xì)胞膜碎片上，離心時容易被沉淀下來，而質(zhì)粒DNA則留在上清液中，上清液中還可能有蛋白質(zhì)，核糖核蛋白和少量的染色體DNA。

大腸桿菌染色體DNA 抽提首先收集對數(shù)生長期的細(xì)胞，然后用離子型表面活性劑十二烷基磺酸鈉（SDS）破裂細(xì)胞，SDS 具有的主要功能是：

（1）溶解細(xì)胞膜上的脂類和蛋白質(zhì)，因而溶解膜蛋白而破壞細(xì)胞膜；

（2）解聚細(xì)胞膜上的脂類和蛋白質(zhì)，有助于消除染色體DNA上的蛋白質(zhì)；

（3）SDS 能與蛋白質(zhì)結(jié)合成為R1—0—SO3R2—蛋白質(zhì)的復(fù)合物，使蛋白質(zhì)變性而沉淀下來。

SDS 也能抑制核糖核酸酶的作用，所以在以后的提取過程中，必須把它除干凈。以免影響下一步RNase的作用。破細(xì)胞后RNA經(jīng)RNase消化除去，蛋白質(zhì)經(jīng)苯酚、氯仿—異戊醇抽提除去。含有質(zhì)粒DNA的上清液用乙醇或異丙醇沉淀，回收DNA。

此種方法抽提的細(xì)菌染色體DNA，無RNA和蛋白質(zhì)污染，可用于限制性內(nèi)切酶消化，分子再克隆等。但在下一步實(shí)驗(yàn)前，要測定其DNA的濃度，常用測定DNA 濃度的方法，是溴化乙錠電泳法；當(dāng)DNA 樣品在瓊脂糖凝膠中電泳時，加入的EB 會增強(qiáng)發(fā)射的熒光。而熒光的強(qiáng)度正比于DNA 的含量，如將已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品作電泳對照，就可估計(jì)出待樣品的濃度。

本實(shí)驗(yàn)利用的就是使用裂解液（含去污劑SDS）將細(xì)胞壁破壞，裂解后，用乙醇將DNA沉淀下來。 

材料：

①LB液體培養(yǎng)液

②酚/氯仿（1：1）：一般市售的酚需要重蒸處理，市售的酚常含有雜質(zhì)而呈粉色和淡黃色，需要重蒸二次，收集沸點(diǎn)160℃部分，小瓶分裝，瓶內(nèi)空腔充氮?dú)猓?/span>20℃密封保存，以免氧化，用前從冰箱中取出，68℃蒸餾水飽和，加入8—羥基喹啉（100g酚加0.1g），酚變?yōu)辄S色。8—羥基喹啉是抗氧化劑，并能部分抑制核糖核酸酶，含8—羥基喹啉的酚用等體積1.0mol/L pH 8.0Tris 緩沖液抽提，再用0.1mol/L pH 8.0含0.2％β－巰基乙醇的Tris緩沖液抽提數(shù)次，酚溶液的pH應(yīng)大于7.6。此酚溶液在平衡緩沖液覆蓋下4℃可保存一個月，純化和制備酚溶液都要帶手套，以免損傷皮膚。

③核糖核酸酶：無DNA酶污染，將胰RNA酶（RNA酶A）溶于10mmol/LTris－Cl(pH 7.5)15mmol/L Nacl 溶液中，濃度為10mg/ml.于100℃加熱15分鐘，緩慢冷卻至室溫，分裝后于－20℃保存。

④TEG緩沖液：pH8.0 25m mol/L Tris-HCl,10m mol/L EDTA,50m mol/L 葡萄糖,4mg/mL 溶菌酶

⑤標(biāo)準(zhǔn)菌株：大腸埃希氏菌

⑥堿裂解液：0.2mol/L NaOH,1%SDS

⑦乙酸鉀溶液、乙酸鈉溶液、溶菌酶溶液、丙酮溶液。

 

方法與步驟：

1)   將大腸桿菌接種于LB培養(yǎng)基在37°C環(huán)境下，以150r/min震蕩過夜培養(yǎng)。

2)   取1ml對數(shù)期菌液，12000rpm 5min；

3)   棄上清，將沉淀溶于200ul丙酮，震蕩混勻，冰浴5min。

4)   8000rpm離心2min，棄上清。

5)   將沉淀混于TEG緩沖液中，震蕩混勻，冰浴5min

6)   加入200ulSDS裂解液，冰浴5min

7)   加入150ul乙酸鉀溶液，冰浴15min，使其沉淀完全。

8)   4°C下離心，12000rpm，5min。（乙酸鉀能沉淀SDS與蛋白質(zhì)的復(fù)合物，并使過量的SDS-Na+轉(zhuǎn)化為溶解度很低的SDS-K+一起沉淀下來。）離心后，若上清液渾濁，應(yīng)混勻后再冷至0°C，重復(fù)離心。棄去上清

9)   加入等體積的酚-氯仿飽和溶液，反復(fù)震蕩，離心，12000rpm 2min（比單獨(dú)用酚，氯仿除去蛋白質(zhì)效果更好。為充分除去殘余的蛋白質(zhì)，可以進(jìn)行多次抽提，直至兩相間無絮狀蛋白沉淀）。

10)  將上清移至新管，加入2倍體積預(yù)冷無水乙醇，混合搖勻。

11)  -20C，15min后，4°C下離心12000rpm 5min。

12)  1ml 70%冷乙醇洗滌沉淀，然后離心，棄去上清液。

13)  干燥，100ul 20ug/ml RNaseA，37C，30min

14)  2倍體積無水乙醇沉淀，70%冷乙醇洗滌(沉淀DNA可以使用一倍體積異丙醇或2倍體積乙醇。)

15)  干燥，溶于50ul TE

（倒數(shù)一二步是我們制備的DNA馬上就要用的情況，若需保存，則是在使用之前加入RNase。）

革蘭氏陽性菌，由于細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)與陰性菌有差別，裂解比陰性菌稍微麻煩一些，可以采取CTAB/NaCl法稍加修改，在第四步加入終濃度2mg/ml的溶菌酶，37度溫育1h。

 

實(shí)驗(yàn)注意：

1.提基因組最好要將槍頭尖剪掉（剪掉以后在酒精燈上迅速過一下，使其斷口圓滑）。以免槍頭損傷DNA。

2.最好是風(fēng)干。

3.最好能夠使用新鮮的菌體。過程中注意無菌操作。

4.菌量有一定的要求，通常為菌液的OD600=1.9時，取1-2ml就可以了。

5.第一步懸浮時，振蕩的時間稍長一些（1-2分鐘），充分懸浮菌體。

6.裂解步驟中，如果不澄清說明菌體沒有裂解，可能的原因有：a。菌量太大；b。該菌為厚壁的非革蘭氏陰性菌。

7.沉淀DNA可以使用一倍體積異丙醇或2倍體積乙醇。

8.加洗液Rnase A，量要加足，以防止清洗不凈影響未來的實(shí)驗(yàn)。

9. 要盡可能地溫和操作，減少剪切力，減少切斷DNA 分子的可能性；分子熱運(yùn)動也會減少所抽提到的DNA分子量，所以提取過程也要盡可能在低溫下進(jìn)行。

10.加入乙酸鉀后，可用小玻璃棒輕輕攪開團(tuán)狀沉淀物，防止DNA被包埋在沉淀物內(nèi)，不易釋放出來。

11.注意在吸取上層水相時勿吸入下層有機(jī)相。

 廣州健侖生物科技有限公司研究所

徐華