逆轉(zhuǎn)錄PCR

RT-PCR即逆轉(zhuǎn)錄PCR。

RT-PCR 為反轉(zhuǎn)錄PCR（reverse transcription PCR）和實時PCR（real time PCR）共同的縮寫。逆轉(zhuǎn)錄PCR，或者稱反轉(zhuǎn)錄PCR(reverse transcription-PCR, RT-PCR)，是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的一種廣泛應(yīng)用的變形。在RT-PCR中，一條RNA鏈被逆轉(zhuǎn)錄成為互補DNA，再以此為模板通過PCR進(jìn)行DNA擴增。

1mode逆轉(zhuǎn)錄PCR

由一條RNA單鏈轉(zhuǎn)錄為互補DNA(cDNA)稱作“逆轉(zhuǎn)錄”，由依賴RNA的DNA聚合酶（逆轉(zhuǎn)錄酶）來完成。隨后，DNA的另一條鏈通過脫氧核苷酸引物和依賴DNA的DNA聚合酶完成，隨每個循環(huán)倍增，即通常的PCR。原先的RNA模板被RNA酶 H降解，留下互補DNA。

RT-PCR的指數(shù)擴增是一種很靈敏的技術(shù)，可以檢測很低拷貝數(shù)的RNA。RT-PCR廣泛應(yīng)用于遺傳病的診斷，并且可以用于定量監(jiān)測某種RNA的含量。（檢測基因表達(dá)的方法，參見Northern Blot法。

RT-PCR的關(guān)鍵步驟是在RNA的反轉(zhuǎn)錄，要求RNA模版為完整的且不含DNA、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)。常用的反轉(zhuǎn)錄酶有兩種，即鳥類成髓細(xì)胞性白細(xì)胞病毒（avian myeloblastosis virus,AMV）反轉(zhuǎn)錄酶和莫羅尼鼠類白血病病毒（moloney murine leukemia virus,MMLV）反轉(zhuǎn)錄酶。

RT-PCR有時候也會指代實時PCR(real-time PCR)。為了與逆轉(zhuǎn)錄PCR相區(qū)別，通常被寫作“定量PCR”(quantitative PCR)或者RTQ-PCR(real-time quantitative PCR)。

2實時PCR

實時PCR(real-time PCR)，屬于定量PCR（Q-PCR）的一種，以一定時間內(nèi)DNA的增幅量為基礎(chǔ)進(jìn)行DNA的定量分析。

real time PCR 的定量使用熒光色素，目前有二種方法。一種是在ds DNA中插入特異的熒光色素，例如SYBR Green熒光染料；另一種使用一種能與增幅DNA序列中特定寡核酸序列相結(jié)合的一種熒光探針（probe），如Taqman探針。兩種方法原理不同。SYBR Green熒光染料游離時不發(fā)光，當(dāng)反應(yīng)體系中存在雙鏈DNA時，SYBR Green與雙鏈DNA結(jié)合，此時才發(fā)光。Taqman探針帶有一個熒光基團(tuán)和一個淬滅基團(tuán)，熒光基團(tuán)連接在探針的5’末端，而淬滅基團(tuán)則在3’末端。PCR擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，探針完整時，報告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號被淬滅基團(tuán)吸收；PCR擴增時，Taq酶的5'－3'外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，此時熒光基團(tuán)發(fā)出的熒光信號可以被檢測到。

real time PCR 與 reverse transcription PCR 相結(jié)合，能用微量的RNA來找出特定時間、細(xì)胞、組織內(nèi)的特別表達(dá)的遺傳基因。這兩種RT PCR的組合又被稱之為“定量RT-PCR（quantitative RT-PCR）”

3RT-PCR技術(shù)相關(guān)試劑

oligo: 多聚體，相當(dāng)于mRNA引物

AMV RT：禽類成髓細(xì)胞瘤病毒逆轉(zhuǎn)錄酶

MMLV RT：莫洛尼鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶

dNTPs：脫氧核苷酸

RNase：RNA水解酶

PCR Buffer：RT-PCR緩沖液

MgCl2：2價鎂離子

PCR各步驟的目的

預(yù)變性

破壞DNA中可能存在的較難破壞的二級結(jié)構(gòu)。使DNA充分變性，減少DNA 復(fù)雜結(jié)構(gòu)對擴增的影響，以利于引物更好的和模板結(jié)合，特別是對于基因組來源的DNA模板，最好不要吝嗇這個步驟。此外，在一些使用熱啟動Taq酶的反應(yīng)中，還可激活Taq酶，從而使PCR反應(yīng)得以順利進(jìn)行。

三種循環(huán)

①模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至93℃左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備；

②模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結(jié)合；

③引物的延伸：DNA模板--引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA 鏈互補的半保留復(fù)制鏈。

延伸時間原因

用PCR儀擴增時,(變性.退火,延伸)循環(huán)完成后,繼續(xù)72度延伸了10分鐘的原因：

1.延伸時間取決于待擴增DNA片段的長度。（當(dāng)然是在反應(yīng)體系一定的條件下）例如，使用TaqDNA聚合酶，72度時的堿基摻入率為35-100bp/s，因此延伸速率為1kb/min。

2.根據(jù)延伸速率推得，擴增1kb以內(nèi)的DNA片段1min即可，而3-4kb則需要3-4min，依次照推。通常在最后一輪要適當(dāng)?shù)膶⒀由鞎r間延長至4-10min，這樣做是使PCR反應(yīng)完全以提高擴增產(chǎn)量。

3.繼續(xù)72度延伸了10分鐘除了可以使PCR反應(yīng)完全以提高擴增產(chǎn)量外，還有一個作用是：在用普通Taq酶進(jìn)行PCR擴增時在產(chǎn)物末端加A尾的作用，可以直接用于TA克隆的進(jìn)行。

PCR引物的選擇

對靶序列中潛在的引物位點進(jìn)行分析， 這些位點應(yīng)該不會形成同源多聚體機構(gòu)，也沒有明顯的形成二級結(jié)構(gòu)的趨勢，不會自身互補，與基因組中的其他序列無顯著的同源性。

（1）依據(jù)寡核苷酸引物與其靶序列形成雜合分子的熔解度的計算中提供的公式計算各引物的熔解溫度。

（2）選擇一對匹配完好的正向和反向引物。兩條引物的G+C含量相似，將產(chǎn)生一種大小和堿基組成合適的產(chǎn)物。兩條引物與所擴增片段的GC含量都應(yīng)在40%-60%之間。

（3）對寡核苷酸的長度和/或位置進(jìn)行細(xì)調(diào)。使得引物的3‘末端核苷酸為G或C。檢查兩條寡核苷酸之間有無明顯的互補性。作為一條經(jīng)驗性的規(guī)律，一條引物上不該含有三個連續(xù)的與另一條引物互補的核苷酸。

注意事項

(1)雙鏈DNA的變性溫度是由雙鏈中C+G的含量決定的，C+G含量越高，模板DNA的溶解溫度就越高。在選擇的變性溫度下，模板鏈越長變性所需時間就越長。如果變性溫度過低或變性時間過短，會使僅僅富含A+T區(qū)域變性。當(dāng)模板DNA的G+C含量超過55%的時需要更高的變性溫度。

(2) 復(fù)性過程采用的溫度至關(guān)重要如果復(fù)性溫度太高，寡核苷酸引物不能與模板很好的復(fù)性，擴增效率將會降低。如果復(fù)性溫度太低，引物將產(chǎn)生非特異性復(fù)性，從而導(dǎo)致非特異性的DNA片段的擴增。復(fù)性通常在比理論計算的引物和模板的溶解溫度低3—5℃的條件下進(jìn)行。

（3）PCR擴增所需的循環(huán)數(shù)目決定于反應(yīng)體系中起始的模板拷貝數(shù)以及引物延伸和擴增的效率。一旦PCR反應(yīng)進(jìn)入幾何級數(shù)的增長期，反應(yīng)會一直持續(xù)下去，直至某一成分成為限制因素。從這一點上來說，擴增產(chǎn)物中絕大多數(shù)應(yīng)該是特異性的擴增產(chǎn)物，而非特異性的擴增產(chǎn)物應(yīng)該低到難以檢測到的程度。用TaqDNA聚合酶（效率為0.7）在一個含有10的5次方個拷貝的靶序列的反應(yīng)體系中進(jìn)行30個循環(huán)后往往可以做到上述的理想情況。